РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И РЕЖИМОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ LACTOBACILLUS REUTERI ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА
Рубрики: ТЕХНОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
Авторы:
1.
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»
2.
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»
3.
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»
4.
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности»
Тип:
Статья
Страницы:
с 56
по 62
Статус:
Опубликован
Получено:
20.09.2016
Одобрено:
20.09.2016
Опубликовано:
20.09.2016
Классификаторы:
УДК 637.14
УДК 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
УДК 60 Прикладные науки. Общие вопросы
УДК 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
УДК 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Язык материала:
русский
Ключевые слова:
Пробиотический штамм, Lactobacillus reuteri, ферменты, Alcalase, Neutrase, Protamex, протосубтилин, культивирование, бактериальный концентрат
Аннотация (русский):
Lactobacillus reuteri был выделен во ВНИМИ. Данный вид лактобактерий обладает широким спектром функциональных свойств, поэтому разработка бактериального концентрата L. reuteri является актуальной и востребованной. Цель исследований заключалась в выборе ферментного препарата, позволяющего получить гидролизаты белков из обезжиренного молока и сыворотки как основы для создания питательной среды, а также в изучении влияния некоторых факторов (дозы протеолитического фермента, продолжительности гидролиза), в проведении оптимизации питательной среды различными компонентами и подборе технологических режимов (температуры, рН среды, дозы инокулята) культивирования L. reuteri . Для исследований были выбраны 4 протеолитических фермента (протосубтилин, Alcalase, Neutrase, Protamex) в концентрации 0,4 и 3 %. Продолжительность процесса гидролиза 1,5 и 3 ч, температура процесса 55 °С, активная кислотность 7,2 ед. рН. С целью оптимизации состава питательной среды проведены исследования по влиянию отдельных компонентов (гидролизат, дрожжевой экстракт, сахароза, цистеин, инулин) на ее питательную ценность. Исследовано влияние технологических режимов культивирования L. reuteri (активная кислотность 5,6-6,6 ед. рН, температура культивирования 32-41 °С, доза инокулята от 3 до 8 %) на накопление клеток в среде. Анализ полученных данных показал, что при культивировании на гидролизате, полученном на обезжиренном молоке, количество клеток было выше, чем на гидролизате, полученном на сыворотке. При исследовании влияния вида и дозы вносимого фермента установлено, что исследованные ферменты обладали практически одинаковым воздействием на накопление клеток L. reuteri , при повышении дозы фермента интенсивность развития клеток возрастала. Установлен оптимальный состав питательной среды для культивирования L. reuteri : гидролизат 96,75 %, дрожжевой экстракт 3 % и инулин 0,25 %. Установлены оптимальные технологические режимы культивирования L. reuteri : температура 37 °С, активная кислотность 6,2 ед. рН, доза инокулята 6-7 %, продолжительность культивирования 6-8 ч. При этих параметрах количество клеток составило 2×109 КОЕ/см3.
Lactobacillus reuteri был выделен во ВНИМИ. Данный вид лактобактерий обладает широким спектром функциональных свойств, поэтому разработка бактериального концентрата L. reuteri является актуальной и востребованной. Цель исследований заключалась в выборе ферментного препарата, позволяющего получить гидролизаты белков из обезжиренного молока и сыворотки как основы для создания питательной среды, а также в изучении влияния некоторых факторов (дозы протеолитического фермента, продолжительности гидролиза), в проведении оптимизации питательной среды различными компонентами и подборе технологических режимов (температуры, рН среды, дозы инокулята) культивирования L. reuteri . Для исследований были выбраны 4 протеолитических фермента (протосубтилин, Alcalase, Neutrase, Protamex) в концентрации 0,4 и 3 %. Продолжительность процесса гидролиза 1,5 и 3 ч, температура процесса 55 °С, активная кислотность 7,2 ед. рН. С целью оптимизации состава питательной среды проведены исследования по влиянию отдельных компонентов (гидролизат, дрожжевой экстракт, сахароза, цистеин, инулин) на ее питательную ценность. Исследовано влияние технологических режимов культивирования L. reuteri (активная кислотность 5,6-6,6 ед. рН, температура культивирования 32-41 °С, доза инокулята от 3 до 8 %) на накопление клеток в среде. Анализ полученных данных показал, что при культивировании на гидролизате, полученном на обезжиренном молоке, количество клеток было выше, чем на гидролизате, полученном на сыворотке. При исследовании влияния вида и дозы вносимого фермента установлено, что исследованные ферменты обладали практически одинаковым воздействием на накопление клеток L. reuteri , при повышении дозы фермента интенсивность развития клеток возрастала. Установлен оптимальный состав питательной среды для культивирования L. reuteri : гидролизат 96,75 %, дрожжевой экстракт 3 % и инулин 0,25 %. Установлены оптимальные технологические режимы культивирования L. reuteri : температура 37 °С, активная кислотность 6,2 ед. рН, доза инокулята 6-7 %, продолжительность культивирования 6-8 ч. При этих параметрах количество клеток составило 2×109 КОЕ/см3.
Ключевые слова:
Пробиотический штамм, Lactobacillus reuteri, ферменты, Alcalase, Neutrase, Protamex, протосубтилин, культивирование, бактериальный концентрат
Пробиотический штамм, Lactobacillus reuteri, ферменты, Alcalase, Neutrase, Protamex, протосубтилин, культивирование, бактериальный концентрат
Введение В последние годы наблюдается большой интерес к кисломолочным продуктам, содержащим микроорганизмы - пробиотики (бифидобактерии, ацидофильные молочнокислые палочки, L. rhamnosus, L. casei, пропионовокислые бактерии и др.), которые являются представителями нормальной кишечной микрофлоры человека. В настоящее время большое внимание уделяется изучению свойств пробиотического микроорганизма Lactobacillus reuteri. Исследования последних десятилетий выявили способность молочнокислых бактерий образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия [1]. Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта, и поэтому они могут заменить традиционные химические [2, 3, 4]. Lactobacillus reuteri обитает в кишечнике человека и животных, продуцирует бактериоцин реутерин, который ингибирует кишечные патогены и стимулирует иммунную систему человека. Lactobacillus reuteri облигатная гетероферментативная молочнокислая палочка, микроаэрофил. Lactobacillus reuteri продуцируют большое количество глюканов и фруктанов и других экзополисахаридов, которые рассматриваются как пребиотики. Так как данный вид лактобактерий обладает широким спектром функциональных свойств, разработка импортозамещающей биотехнологии бактериального концентрата Lactobacillus reuteri, предназначенного для производства продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами, на сегодняшний день является актуальной и востребованной. Процесс получения бактериального концентрата включает в себя наращивание клеток молочнокислых бактерий в питательной среде и их отделение центрифугированием. При этом необходимо накопить в среде максимально возможное количество активных клеток. В качестве азотистой основы для питательных сред широко используются гидролизаты белков молока. Степень гидролиза белковых субстратов и пептидный состав гидролизата зависят от многих факторов, таких как: вид и специфичность фермента, концентрация фермента и продолжительность ферментации, рН и температура ферментации и т.д. Целью настоящих исследований является выбор наиболее эффективного ферментного препарата, позволяющего получить гидролизаты белков из обезжиренного молока и сыворотки как основы для создания питательной среды, а также изучить влияние некоторых факторов (доза протеолитического фермента, продолжительность гидролиза), провести оптимизацию питательной среды различными компонентами и подобрать технологические режимы (температура, рН среды, доза инокулята клеток) культивирования L. reuteri для разработки бактериального концентрата. Объекты и методы исследований Объектом исследования является штамм Lactobacillus reuteri, выделенный в 2014 году в Центральной лаборатории микробиологии ФГБНУ «ВНИМИ». Штамм Lactobacillus reuteri хранили в замороженном состоянии при температуре минус 80 °С в растворе, содержащем 6 % обезжиренного сухого молока и 10 % глицерина. Для восстановления культуры использовали среду MRS, температуру культивирования 37 °С и анаэробные условия. Для исследований были выбраны 4 протеолитических фермента (протосубтилин, Alcalase, Neutrase, Protamex). Работы по подбору питательной среды для культивирования L. reuteri проводили поэтапно: на первом - осуществляли гидролиз обезжиренного молока и сыворотки. Исходя из литературных источников и предшествующих исследований [5, 6, 7] для эксперимента были выбраны две концентрации ферментов: 0,4 и 3 %, продолжительность гидролиза составила 1,5 и 3 ч. Согласно рекомендациям производителей температура и активная кислотность процесса составляли 55 °С и 7,2 ед. рН соответственно. Полученные гидролизаты были исследованы как питательные среды для накопления максимального количества клеток L. reuteri. Процесс культивирования проводили при температуре 37 °С в течение 16-17 ч, доза инокулята составляла 5 %. После 17 ч культивирования определяли количество клеток (чашечным методом на среде MRS в анаэробных условиях). При разработке состава питательной среды для наращивания биомассы L. reuteri использовались следующие компоненты: гидролизованное молоко, дрожжевой экстракт, инулин, сахароза и цистеин. Все полученные данные обрабатывались в программе Statistica 6.1 [8, 9]. Известно, что оптимальная температура роста и рН питательной среды для молочнокислых палочек составляет 37-41 °С и рН = 5,4-6,4 ед. рН, тогда как из литературных источников, посвященных различным исследованиям с Lactobacillus reuteri, авторы используют следующие значения температур и активной кислотности для культивирования микроорганизма: 38 °С и рН - 6,2 ед. рН, 37 °С и рН - 6,5 ед. рН, рН - 6,0-6,8 ед. рН, рН - 5,8 ед. рН и 37 °С [10]. Исходя из вышеизложенного в работе по подбору режимов культивирования микроорганизма Lactobacillus reuteri был взят следующий интервал значений активной кислотности рН: 5,6; 5,8; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6 ед. рН и температуры 32, 35, 37, 39, 41 °С. Культивирование Lactobacillus reuteri проводили в ферментерах фирмы Das Gip (Германия) на 400 мл, а затем в ферментере Prelude фирмы Biolafitt на 5 л (Франция) при постоянных значениях активной кислотности или температурах и непрерывном раскислении водным раствором NaOH с массовой долей 30 %. Инокулят готовили на среде MRS и вносили в количестве 5 % во всех опытах. Через каждые 2 ч культивирования проводили отбор проб и определяли количество клеток Lactobacillus reuteri. Количество клеток Lactobacillus reuteri определяли методом предельных разведений в среде ГМК-1 в анаэробных условиях и термостатировании в течение 3-5 дней при температуре 37 °С в соответствии с Методическими рекомендациями по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях цельномолочной и молочно-консервной промышленности [11]. Результаты и их обсуждение Математическая обработка данных экспериментов по влиянию вида ферментов и режимов гидролиза показала, что такие факторы, как «вид среды», «вид фермента» и «доза фермента», оказывали значимый эффект на развитие клеток L. reuteri. Было установлено, что наибольшее количество клеток было получено на гидролизате, приготовленном на обезжиренном молоке - 8,8×107 КОЕ/см3, тогда как на гидролизованной сыворотке - 9,1×106 КОЕ/см3. На рис. 1 представлены данные по влиянию вида фермента на накопление клеток L. reuteri. . Рисунок1 Рис. 1. Влияние вида фермента на накопление клеток L. reuteri в гидролизованном обезжиренном молоке Так, на гидролизате, полученном с использованием фермента Alcalase при культивировании в течение 16-17 ч, количество клеток составило 6,6×107 КОЕ/см3, тогда как для фермента Neutrase оно составляло 4,9×107 КОЕ/см3 и протосубтилина - 4,7×107 КОЕ/см3, Protamex - 2,5 ×107 КОЕ/см3. Исследования показали, что при повышении дозы фермента с 0,4 до 3 % интенсивность развития клеток возрастала. Также определено, что продолжительность гидролиза среды от 1,5 до 3 ч различными ферментами не влияла на питательную ценность получаемых сред, не давая различий в количестве клеток L. reuteri. Таким образом, на основании полученных данных в дальнейших исследованиях для получения гидролизованного обезжиренного молока был выбран протеолитический фермент Alcalase с дозой внесения 3 %. С целью оптимизации состава питательной среды был разработан 5-факторный центральный композиционный план со следующим диапазоном варьирования ингредиентов: гидролизованное молоко 30-100 %, дрожжевой экстракт 0-5 %, сахароза 0-5 %, инулин 0-1 г/дм3. Проведенные исследования показали, что добавление сахарозы угнетает рост клеток L. reuteri. На рис. 2 и 3 представлены поверхности отклика влияния содержания сахарозы (без добавления и при 5 %) на количество клеток в питательной среде. Рисунок2 Рис. 2. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 0 % Рисунок3 Рис. 3. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 5 % Проведенные исследования показали, что наибольшее накопление клеток L. reuteri было получено на питательной среде без добавления сахарозы. На развитие и рост клеток в процессе культивирования влияло взаимодействие факторов «Гидролизат - Инулин» и «Дрожжевой экстракт - Цистеин». Было установлено, что с увеличением содержания инулина в составе питательной среды количество клеток возрастало. Тогда как ингредиенты дрожжевой экстракт и цистеин в составе питательной среды могут быть взаимозаменяемы (рис. 4 и 5). Рисунок4 Рис. 4. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации цистеина и дрожжевого экстракта в среде Рисунок6 Рис. 5. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации инулина и гидролизата в питательной среде Таким образом, было установлено, что добавление инулина, дрожжевого экстракта или цистеина в гидролизованное молоко стимулирует развитие L. reuteri, тогда как сахароза подавляет. Поэтому в дальнейших исследованиях была проведена оптимизация состава питательной среды из следующих компонентов: гидролизованное молоко, инулин, дрожжевой экстракт или цистеин. Было исследовано влияние количества вносимого дрожжевого экстракта от 0 до 5 %, инулина от 0 до 1 % и гидролизованного молока от 30 до 100 %. Наибольшее количество клеток Lactobacillus reuteri было получено с использованием разработанного состава питательной среды, содержащей гидролизованное ферментом Alcalase молоко - 96,75 %, дрожжевой экстракт - 3 %, инулин - 0,25 %. Проведены исследования по влиянию размножения Lactobacillus reuteri при культивировании при различных значениях активной кислотности (5,8; 6,0; 6,2 ед. pH) и температурах (32; 35; 37; 39; 41 °С). Доза вносимого инокулята составляла 5 %. На рис. 6 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 5,8 ед. рН при различных температурах культивирования: 32, 35, 37, 39 и 41 °С. Анализ представленных данных показывает, что наибольшее содержание клеток было получено при культивировании при температуре 35, 37 °С и достигало 1,4×109 КОЕ/см3 и 1,5×109 КОЕ/см3 соответственно. Рис. 6. Изменение содержания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 5,8 ед. рН Рис. 7. Изменение содержания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,0 ед. рН На рис. 7 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 6,0 ед. рН при различных температурах культивирования: 32, 35, 37, 39 и 41 °С. Наибольшее количество клеток (1,6×109 и 2,4×109 КОЕ/см3) было отмечено при культивировании при температуре 35 и 37 °С. На рис. 8 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 6,2 ед. рН при различных температурах культивирования: 32, 35, 37, 39 и 41 °С. Рис. 8. Изменение содержания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,2 ед. рН 1 Рис. 9. Изменение содержания клеток при культивировании при различных значениях активной кислотности Исходя из данных, представленных на рис. 8, видно, что при температуре 35, 37 °С и активной кислотности рН = 6,2 ед. рН также отмечалось высокое количество клеток в культуральной среде. Как видно из рис. 9, интенсивное накопление клеток происходило в течение 8-10 ч (при внесении 5 % инокулята) и разница в количестве клеток в стационарной фазе роста при культивировании при разных значениях активной кислотности была невелика, варьировалась в интервале 7,5×108-1,75×109 КОЕ/см3. Однако наибольшее количество клеток было достигнуто при культивировании при более низких значениях активной кислотности в интервале рН от 5,8 до 6,2 ед. рН. Так, при активной кислотности среды 5,8 ед. рН наибольшее количество клеток составило 1,5×109 КОЕ/см3, при 6,0 ед. рН - 1,75×109 КОЕ/см3 и при 6,2 ед. рН - 1,4×109 КОЕ/см3. По полученным данным было установлено, что наибольшее содержание клеток L. reuteri было достигнуто при температуре 37 °С и активной кислотности 6,2 ед. рН. Следует отметить, что максимум концентрации живых клеток в питательной среде наблюдался через 8-10 ч культивирования L. reuteri. При исследовании динамики размножения Lactobacillus reuteri в зависимости от дозы вносимого инокулята и различной продолжительности культивирования использовали активную кислотность 6,2 ед. pH и температуру культивирования 37 °С. В ходе исследований доза инокулята составляла 3, 4, 5, 6, 7 и 8 %. Анализ полученных данных показал, что интенсивность размножения Lactobacillus reuteri зависит от количества внесенного инокулята. Максимальное количество клеток Lactobacillus reuteri отмечалось через 6-8 ч культивирования при внесении 6-7 % инокулята и составило 2×109 КОЕ/см3. В ходе исследований также определяли количество клеток Lactobacillus reuteri в биомассе, полученной после культивирования при внесении различных доз инокулята, после ее отделения на суперцентрифуге. Наибольшее количество клеток Lactobacillus reuteri накапливалось при получении биомассы после отделения клеток на суперцентрифуге при внесении 6 % инокулята и составило 1011 КОЕ/см3. Выводы 1. Наибольшее количество клеток было получено при культивировании L. reuteri в питательной среде с гидролизованным молоком при использовании протеолитического фермента Alcalase в количестве 3 % от содержания белка в среде. Оптимальный состав питательной среды состоял из 96,75 % гидролизованного молока, 3 % дрожжевого экстракта, 0,25 % инулина и обеспечивал интенсивное развитие и накопление клеток Lactobacillus reuteri. 2. При исследовании влияния активной кислотности среды и температуры культивирования L. reuteri на накопление клеток было установлено, что оптимальной температурой культивирования является температура 37 °С и активная кислотность 6,2 ед. рН. Количество клеток при данных параметрах составляло 1,4×109 КОЕ/см3. 3. При исследовании влияния дозы вносимого инокулята на интенсивность размножения L. reuteri установлено, что максимальное количество клеток L. reuteri отмечалось через 6-8 ч культивирования при внесении 6-7 % инокулята (2×109 КОЕ/см3). 4. Установлено, что наибольшее количество клеток Lactobacillus reuteri накапливалось при получении биомассы после отделения клеток на суперцентрифуге при внесении 6 % инокулята и составило 1011 КОЕ/см3.
1. Стоянова, Л.Г. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства (обзор) / Л.Г. Стоянова, Е.А. Устюгова, А.Н. Нетрусов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2012. - Т. 48. - № 3. - С. 644-650.
2. Изучение антибиотического комплекса, образуемого Lactococcus lactis subsp. Lactis 194 вариант - К / Е.А. Устюгова [и др.] // Микробиология. - 2011. - Т. 80. - № 5. - С. 644-685.
3. Elizete de F.R. Pancheniak. Molecular characterization and biomass and metabolite production of Lactobacillus reuteri LPB P01-001: A potential probiotic/ Elizete de F.R. Pancheniak, Maike T. Maziero, Jose A. Rodriguez-Leon, Jose L. Parada, Michele R. Spier, Carlos R. Soccol// Brazilian Journal of Microbiology. - 2012. -P. 135-147.
4. Filipe Santos. Effect of amino acid availability on vitamin B12 production in Lactobacillus reuteri/ Filipe Santos, Bas Teusink, Douwe Molenaar, Maurice van Heck, Michiel Wels, Sander Sieuwerts, Willem M. de Vos, Jeroen Hugenholtz// Applied and environmental microbiology. - V. 75. - N 12. - 2009. - P. 3930-3936.
5. Закономерности гидролиза сывороточных белков экзо- и эндопротеазами / Т.Н. Головач, Н.В. Гавриленко, Н.К. Жабанос, В.П. Курченко // Труды БГУ. - 2008. - Т. 3. - Ч. 1. - С. 1-15.
6. Головач, Т.Н. Культивирование молочнокислых бактерий в питательных средах на основе гидролизатов белков молока / Т.Н. Головач // Труды БГУ. - 2010. - Т. 5. - Ч. 1. - С. 118-126.
7. Головач, Т.Н. Гидролиз белков молока ферментными препаратами и протеолитическими системами молочнокислых бактерий // Труды БГУ. - 2012. - Т. 7. - Ч. 1. - С. 106-120.
8. Magdalena Polak-Berecka, Adam Wasko, Monicka korolowska-Wiater, Marcin Podlesny, Zdzislaw Targonski, Agnieszka Kubik-Komar. Optimization of Medium composition for enhancing growth of lactobacillus rhamnosus PEN using persponse surface methodology// Polish Journal of Microbiology, Vol.59, № 2, 2010, P. 113-118.
9. Конструирование питательной среды для культивирования пробиотического микроорганизма Lactobacillus reuteri / Т.А. Раскошная, В.Ф. Семенихина, И.В. Рожкова, А.В. Бегунова // Молочная промышленность. - 2015. - № 4. - С. 26-27.
10. Смирнов, Е.А. Совершенствование научных и разработка практических аспектов биотехнологии моновидовых бактериальных концентратов молочнокислых микроорганизмов для сыроделия: автореф. дис.. канд. техн. наук / Е.А. Смирнов. - Вологда, 2011.
11. Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях цельномолочной и молочно-консервной промышленности / Регистрационное свидетельство № 12253 от 26.02.2009. - М., 2009.
