ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРОДУКТОВ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Авторы:
1.
ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»
2.
ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»
3.
ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет»
(ведущий научный сотрудник научно-исследовательского института биотехнологии)
Кемерово, Кемеровская область, Россия
Кемерово, Кемеровская область, Россия
Тип:
Статья
Страницы:
с 126
по 129
Статус:
Опубликован
Получено:
25.06.2014
Одобрено:
25.06.2014
Опубликовано:
25.06.2014
Классификаторы:
УДК [641:613.26]:542.952.6
УДК 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
УДК 60 Прикладные науки. Общие вопросы
УДК 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
УДК 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Язык материала:
русский
Ключевые слова:
Продовольственное сырье, выделение, идентификация, фальсификация, методика, ДНК, полимеразная цепная реакция
Аннотация (русский):
Проанализирована методика выделения нуклеиновых кислот из плодово-ягодного сырья. Выбран наиболее эффективный и доступный метод выделения растительной ДНК из исследуемого растительного сырья. По результатам проделанной работы выявлены преимущества метода полимеразной цепной реакции.
Проанализирована методика выделения нуклеиновых кислот из плодово-ягодного сырья. Выбран наиболее эффективный и доступный метод выделения растительной ДНК из исследуемого растительного сырья. По результатам проделанной работы выявлены преимущества метода полимеразной цепной реакции.
Ключевые слова:
Продовольственное сырье, выделение, идентификация, фальсификация, методика, ДНК, полимеразная цепная реакция
Продовольственное сырье, выделение, идентификация, фальсификация, методика, ДНК, полимеразная цепная реакция
Введение Обеспечение населения качественным продовольственным сырьем имеет актуальное значение в настоящее время в нашей стране и в мире в целом. Качественное и сбалансированное питание является залогом здоровья к полноценному развитию организма. Человек в независимости от своего возраста должен получать здоровую полноценную пищу, чтобы обеспечить себя всеми необходимыми микро- и макроэлементами, витаминами и другими важными для организма питательными веществами. Качественные продукты питания оказывают влияние не только на здоровье одного человека, но и на общество в целом - это демографические, социальные, политические аспекты, которые происходят в государстве, а также обеспечение стабильности и безопасности государства в окружающем мире. С увеличением объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе плодово-ягодным сырьем, готовых продуктов и полуфабрикатов на его основе, возрастает возможность расширения их фальсификации по структуре и видовой принадлежности. На сегодня фальсификация продукции существует в любой отрасли промышленности [1]. Возросший поток товаров иностранных производителей, нетрадиционных для отечественного рынка, и значительное количество малых предприятий, изготовляющих продукцию по собственным рецептурам, так же усугубляют ситуацию. В основном пищевые предприятия могут фальсифицировать содержание плодово-ягодной продукции различными красителями, ароматизаторами, путем добавления мякоти, введения без декларирования сахаров и кислот, купажирования дорогих и дешевых соков дешевыми, использования нестандартного сырья. Самым сложным в экспертизе является определение фальсификации переработанных плодов и ягод. Особенно трудно убедиться в качестве концентратов из экзотических фруктов [2]. Чаще всего фальсифицируют малоценное ягодное сырье, реализуя его как продукцию высокого качества, в результате чего развитие и укрепление контроля за качеством и безопасностью продуктов питания является одним из наиболее приоритетных направлений в настоящее время. Для определения видовой принадлежности и выявления фальсификации плодово-ягодного сырья апробированы и используются органолептические и некоторые физико-химические методы определения, основанные на таких показателях, как содержание растворимых сухих веществ, состав моно- и дисахаридов, состав и содержание органических кислот, аминокислот и т.д. К сожалению, данные методы анализа не дают возможности однозначно установить видовую принадлежность плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах и готовой продукции на его основе. Поэтому особую актуальность в настоящее время приобретает разработка современных высокоэффективных методов выявления фальсификаций продукции. Увеличение темпов роста научно-технического прогресса в современном обществе привело к появлению новых экспресс-методов идентификации продовольственного сырья растительного происхождения и пищевой продукции на его основе. Особое место занимает метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). К основным достоинствам данного метода анализа относят: специфичность; универсальность (могут использоваться практически любые материалы); высокую чувствительность (возможность выявлять единичные копии ДНК); малый объем биологического материала (проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы - до нескольких микролитров); высокую скорость получения результата анализа [3, 4]. Целью настоящего исследования являлся анализ влияния технологической обработки растительного сырья на эффективность видовой идентификации с помощью ПЦР-анализа. Объект и методы исследования В качестве объекта исследования использовались ДНК пищевых продуктов, а именно повидла, самостоятельно приготовленного на основе следующих фруктов и ягод: вишни/черешни, банана, киви. Результаты и их обсуждение Извлечения ДНК из продуктов питания на основе растительного сырья осуществляли с использованием различных методов экстракции: 1 - метод фенольной экстракции; 2 - метод с применением коммерческого набора «ПРОБА-ЦТАБ» (комплект реагентов для выделения растительной ДНК); 3 - метод с применением коммерческого набора «Сорб-ГМО-А». В первом методе для выделения ДНК на стадии отмывания и преципитации используется химический способ - растворители, а во втором и третьем случаях - сорбент в виде эмульсии. Степень чистоты выделенных нуклеиновых кислот определяли с помощью спектрофотометрического метода анализа. В табл. 1 представлена сравнительная характеристика методик выделения ДНК из плодово-ягодного сырья. В ходе исследования все рассмотренные методы позволили выделить ДНК из исследуемых образцов независимо от используемого объекта. В табл. 2 представлена сравнительная характеристика чистоты выделенной ДНК продовольственного сырья. Таблица 1 Сравнительная характеристика методик выделения ДНК из плодово-ягодного сырья Параметры сравнения Методы с дополнительной экстракцией фенолом «ПРОБА-ЦТАБ» «Сорб-ГМО-А» Масса навески, мг 100-150 100-150 100-150 Время проведения выделения, ч 2,5 1 1 Очистка ДНК Растворители Сорбент Сорбент Температура инкубации, °C 65 65 60 Продолжительность перемешивания вручную, мин 19 - - Продолжительность центрифугирования за весь период выделения, мин 23 16 9,5 Условия хранения пробы +20 °С 12 часов -20 °С 6 месяцев -20 °С 6 месяцев Таблица 2 Сравнительная характеристика чистоты выделенной ДНК продовольственного сырья Название набора для выделения ДНК Объект исследования Чистота ДНК при А260/280 Концентрация выделенной ДНК, мг/г С дополнительной экстракцией фенолом Повидло вишневое, 100 % 1,76 0,35 Повидло банановое, 100 % 1,76 0,35 Повидло из киви, 100 % 1,76 0,35 «ПРОБА-ЦТАБ» Повидло банановое, 100 % 2,01 0,39 Повидло из киви, 100 % 1,98 0,38 Повидло вишневое, 100 % 1,98 0,38 Повидло банановое, 100 % 2,01 0,39 Повидло из киви, 100 % 1,98 0,38 «Сорб-ГМО-А» Повидло вишневое, 100 % 1,95 0,42 Повидло банановое, 100 % 1,94 0,43 Повидло из киви, 100 % 1,97 0,44 Степень чистоты выделения дезоксирибонуклеиновых кислот определяли высокочувствительным спектрофотометрическим методом, основанным на поглощении монохроматического потока световой энергии при прохождении его через исследуемый раствор. Результаты экспериментальных данных, представленные в табл. 1, указывают на то, что чистота ДНК при А260/280 нм всех категорий фруктово-ягодных смесей при выделении ДНК первым методом с дополнительной экстракцией фенолом составляет от 1,76 до 1,77; вторым и третьим с применением наборов «ПРОБА-ЦТАБ» и «Сорб-ГМО-А» - от 1, 98 до 2,01 и от 1,94 до 1,98 соответственно. При этом концентрация выделенной ДНК составляет при выделении ДНК первым методом от 0,35 до 0,36 мг/г продукта, вторым - от 0,38 до 0,40 мг/г продукта, третьим - от 0,42 до 0,45. Несмотря на то, что оба коммерческих набора по выделению ДНК позволяют получить растительную ДНК одинаковой чистоты, третий набор при экстракции ДНК с применением набора реагентов «Сорб-ГМО-А» количество выделенной ДНК несколько выше. Следовательно, данный подход дает возможность выбрать наиболее производительный метод выделения растительной ДНК из образцов плодово-ягодного сырья, подвергнутого технологической обработке. Далее исследовали влияние технологической обработки плодово-ягодного сырья на эффективность видовой идентификации с помощью полимеразной цепной реакции. Интерпретацию результатов ПЦР-анализа по определению видовой и родовой принадлежности исследуемых проб производили при помощи сконструированных положительных контролей. Продукты амплификации положительных контролей на электрофореграмме представляли собой яркую четкую полосу. Если на электрофореграмме размер ампликонов по размеру соответствовал ПЦР-ампликону положительного контроля, то такие образцы считали «положительными», то есть содержащими ДНК соответствующего объекта плодово-ягодного сырья. Для контроля реагентов, используемых для ПЦР-анализа, на предмет контаминации ампликонами применяли отрицательный контроль, содержащих ионизованную воду. В электрофоретической дорожке с отрицательным контролем окрашенные полосы должны были отсутствовать. Допускалось присутствие только одной слабо окрашенной полосы, составляющей по размеру менее 50 п.н. В противном случае результаты ПЦР-анализа считали недостоверными. В тех случаях, когда в ходе электрофоретического анализа ПЦР-продуктов из какой-либо пробы был получен неоднозначный результат (слабая окраска, диффузное размывание полос и пр.), проводили повторную амплификацию с той же пробой ДНК. Результаты проведения ПЦР принимали недостоверными, если: - в дорожке с внутренним положительным контролем отсутствовал фрагмент ДНК указанного размера; - в дорожке с отрицательным контролем присутствовала специфическая полоса; - в электрофоретических дорожках присутствовали неспецифические полосы различного размера. Результаты проведения полимеразной цепной реакции.приведены.в.табл..3. Таблица 3 Результаты анализа видовой идентификации при помощи ПЦР № 1 2 3 4 5 6 7 Название образца 1 + Повидло вишневое, 100 % 2 + Повидло банановое, 100 % 3 + Повидло из киви, 100 % 4 χ + + Повидло банановое, 40 % вишневого сока 5 + + Повидло из киви, 40 % вишневого сока Примечание. 1 - Rubus; 2 - Fragaria; 3 - Ribes; 4 - Rоsa; 5 - Prunus; 6 - Musa; 7 - Actinidia; + - положительный результат исследования; χ - отрицательный результат исследования. Анализ экспериментальных данных, представленных в табл. 3, указывает на высокую специфичность и эффективность метода полимеразной цепной реакции при установлении видовой идентификации продовольственного сырья. Выводы Проведенные исследования позволили установить наиболее производительный способ экстракции ДНК. Следовательно, достаточно широко применяется принцип ДНК-амплификации (ПЦР), который отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа. Установлено, что условия обработки продовольственного сырья не влияют на эффективность ПЦР-методов видовой идентификации. Проведенные исследования представляют практический интерес при разработке новой методики идентификации видовой принадлежности растительного сырья.и.продуктов.питания.из.него.
1. Тимофеева, В.А. Товароведение продовольственных товаров: учебник / В.А. Тимофеева. - Изд. 6-е, перераб. и доп. - М.: Изд-во «Феникс», 2006. - 363 с.
2. Комарова, И.Н. Разработка ПЦР-тест-систем для видовой идентификации и количественной оценки мясного сырья в составе мелкоизмельченных полуфабрикатов и готовых мясных продуктов: дис. …канд. техн. наук / Комарова И.Н. - М., 2005. - 182 с.
3. Просеков, А.Ю. Современные методы исследования сырья и биотехнологической продукции / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, С.А. Сухих. - Кемерово, 2013. - 183 с.
4. Просеков, А.Ю. Генная инженерия: учебное пособие / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич. - М.: Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК», 2010. - 216 с.
