Введение Стерины входят в состав обширного класса органических соединений – стероидов, широко распространенных в природе. По своему строению стерины представляют собой до конца гидрированную (пергидро)-1,2-циклопентенфенантреновую кольцевую систему. Это нейтральные, довольно устойчивые вещества, встречающиеся как в свободном состоянии, так и в виде сложных эфиров алифатических жирных кислот. Различные стерины заметно отличаются по своим физиологическим и химическим свойствам в зависимости от наличия и расположения двойных связей в боковой цепи и в кольцевой системе, а также от пространственной изомерии [1, 2]. Стерины обнаружены у представителей всех классов грибов [1, 3]. Наиболее богаты стеринами дрожжевые организмы, способные накапливать от 0,1 до 8,0 % стеринов. Основным стерином большинства дрожжей является эргостерин. Клетки Saccharomyces cerevisiae содержат его до 90 % от общей фракции стеринов [1]. Кроме эргостерина в дрожжах в незначительных количествах встречаются зимостерин, фекостерин, эпистерин, ланостерин и другие стерины. сквален ↓ 1 – эпоксидаза, НАДН-цитохром Р-450-редуктаза, цитохром Р-450 сквален-2,3-оксид ↓ 2 – эпоксидоскваленциклаза ланостерин ↓ 3 – 14-деметилаза 4,4-диметилхолеста-8,24-диен-3β-ол ↓ 4 – оксидаза со смешанной функцией 4-метилхолеста-8,24-диен-3β-ол ↓ 5 – оксидаза зимостерин ↓ 6 – С24-метилтрансфераза фекостерин ↓ 7 – изомераза эпистерин ↓ 8 – С22-дегидрогеназа эргоста-7,22,24(28)-триен-3β-ол ↓ 9 – изомераза эргоста-5,7,22,24(28)-тетраен-3β-ол ↓ 10 – С24(28)-метилредуктаза эргостерин Рисунок 1 – Превращение сквалена в эргостерин у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Figure 1 – Transformation of squalene into ergosterol by the yeast Saccharomyces cerevisiae В настоящее время с помощью меченого ацетата однозначно доказано, что исходной строительной единицей в синтезе стеринов является ацетил-КоА [2]. Важнейший этап в биосинтезе стеринов – образование мевалоновой кислоты, так как она является продуктом, лимитирующим дальнейший синтез. Между количеством этой кислоты в клетке и скоростью синтеза стеринов существует прямая зависимость. Из мевалоновой кислоты через цепь промежуточных веществ образуются изопреновые соединения. Одно из них – фарнезилпирофосфат – заканчивает реакции конденсации с образованием сквалена. Сквален постоянно находится в дрожжах, культивируемых в анаэробных условиях. В этом случае он накапливается в клетке, и его содержание в 10 раз превосходит содержание эргостерина [1]. При аэрировании, особенно в присутствии глюкозы, количество сквалена в клетках быстро уменьшается. Превращение сквалена путем циклизации в ланостерин и затем через ряд переходных соединений в эргостерин в соответствии с общепринятыми взглядами представлено на рис. 1 (цифрами 1–10 обозначены ферменты, катализирующие соответствующую реакцию) [1, 2]. Ферментные системы, осуществляющие биосинтез стеринов, связаны с митохондриями и микросомами [4]. Основными функциями стеринов в клетке являются: структурная, ростовая, защитная [2, 5–7]. Свободные стерины являются составной частью клеточных мембран, а этерифицированные запасаются в липосомах цитоплазмы. Важнейшие свойства клеточной мембраны (вязкость, стабильность, проницаемость, устойчивость к лизису) в существенной степени зависят от состава стеринов. Некоторые исследователи предполагают, что стерины принимают участие в образовании митохондриальных структур [1, 8]. Имеется определенная взаимосвязь между нарушениями в митохондриях и содержанием стеринов в дрожжевых клетках. В дрожжах, растущих в аэробных условиях, при добавлении метразола, затрагивающего окислительный метаболизм клетки, либо при переносе их в анаэробные условия снижается количество стеринов с 2,5 до 0,5 %, убывает число частиц, подобных митохондриям, снижается уровень цитохрома с. При удалении яда из инкубационной среды все нарушенные структуры восстанавливаются, а содержание стеринов достигает первоначального уровня. В свою очередь эргостерин, возможно, является ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 2 91 активатором некоторых ферментных систем и дыхательных коферментов [9]. Дрожжевые организмы способны к определенному росту в анаэробных условиях только в присутствии эргостерина и олеиновой кислоты [10–12]. Рядом авторов [1, 13] выявлена зависимость между концентрацией экзогенного эргостерина и ростом клетки, а также состоянием клеточной мембраны. При минимальной концентрации (100 нг/см3 ), необходимой для роста, эргостерин, вероятно, только заполняет определенные области в клеточной мембране. При этом ее свойства существенно изменены, и клетка способна пройти 2–3 генерации. Это было названо критической доменной функцией эргостерина. Большее количество эргостерина (0,5–1,0 мг/см3 ) приводит к нормальному росту и размножению дрожжей, восстановлению свойств мембран и, следовательно, является достаточным для выполнения доменной функции в клетке. При повышении концентрации экзогенного эргостерина до 15 мг/см3 содержание его в клетке возрастает только до определенного уровня, который остается постоянным и при дальнейшем увеличении количества извне введенного стерина. Дрожжевые клетки, выросшие при анаэробиозе и наличии эргостерина, имеют все хорошо выраженные мембранозные системы: ядерную, цитоплазматическую и вакуолярную мембраны [13]. В структуре клеток, растущих в отсутствии эргостерина, вместо типичных митохондрий имеются промитохондрии со слабой ферментативной активностью, небольшим количеством стеринов, низким содержанием ненасыщенных жирных кислот и высоким – насыщенных с короткой цепью. Аэрация анаэробно выращенных дрожжей в присутствии источника энергии индуцирует быстрый (за 1–8 ч) синтез вышеперечисленных компонентов, дыхательную активность. Клетки начинают делиться, и появляются типичные митохондриальные структуры. Энергетический обмен меняется с анаэробного на окислительный [8]. Стерины способны к комплексообразованию с мембранотропными токсинами (спиртами, солями, полиеновыми антибиотиками и др.), устраняя их негативное влияние на живой организм и выполняя тем самым защитную функцию в клетке [1, 14]. В настоящее время относительно хорошо исследованы условия, при которых происходит стеринообразование у дрожжевых организмов. Аэрация – основной фактор, резко изменяющий уровень образования стеринов в клетках дрожжей рода Saccharomyces [1, 15, 16]. В присутствии кислорода синтез стеринов осуществляется очень быстро. Р. Д Гальцова [1] отмечает, что клетки дрожжей с высокой бродильной активностью могут в условиях хорошей аэрации повысить содержание стеринов в шесть и более раз по сравнению с дрожжами, обладающими значительной окислительной активностью. В первом случае окислительно-восстановительные ферментные системы таким образом лимитируют процессы метаболизма, что накапливается достаточное количество исходного строительного материала, и в то же время наличие окислительных систем и доступ кислорода воздуха обеспечивают необходимую скорость биосинтеза стеринов. При длительном культивировании в отсутствии кислорода дрожжи теряют способность к брожению, прекращают размножаться, перестраивают свой энергетический обмен [8]. Потребность в молекулярном кислороде резко возрастает. Требуемое количество кислорода зависит, с одной стороны, от свойств отдельных штаммов, с другой – от условий их предшествующего культивирования. У разных штаммов пивных дрожжей потребность в кислороде может колебаться от 2,0 до 40,0 мг/дм3 и выше [15, 17–19]. В зависимости от способа введения пивные дрожжи могут получаться в формах, требующих кислород или не требующих его. Микробная культура, выросшая при доступе кислорода воздуха, не нуждается в этом компоненте и хорошо осуществляет процесс брожения как в аэрированном, так и деаэрированном сусле. Дрожжи, растущие длительное время без кислорода, после введения в неаэрированное сусло отличаются пониженной способностью к усвоению субстрата [16, 20]. При проведении процесса ферментации классическим периодическим способом необходимое количество растворенного кислорода в пивном сусле экстрактивностью 11–12 % определяется в размере 6,0–8,0 мг/дм3 , но в ряде случаев предельной концентрацией кислорода на начальной стадии брожения считают 7,5–9,0 мг/дм3 [16–19]. Производство высокоплотных сортов пива, использование технологии «высокоплотного пивоварения» требует насыщения сусла растворенным кислородом на уровне 10,0–18,0 мг/дм3 [18, 21], что позволяет нивелировать дрожжам осмотический стресс, стимулировать сбраживание экстракта среды, снизить долю побочных продуктов, ухудшающих вкус и аромат пива. Некоторые исследователи связывают потребность дрожжей в кислороде, а в свою очередь и скорость сбраживания либо с общей концентрацией стеринов, синтезируемых в присутствии данного количества кислорода, либо с относительным содержанием различных стеринов. Так, например, одни авторы предполагают, что дрожжи с низкой потребностью в кислороде характеризуются большим содержанием эргостерина, чем эпи- и ланостерина [13], другие – высокой концентрацией дигидроэргостерина по сравнению с эргостерином [21]. Накоплению эргостерина благоприятствует нейтральная или щелочная среда, синтез его максимален при 30 °С и почти прекращается при 40 °С. Значительный прирост стеринов (до 10–12 % СВ) наблюдается при воздействии на дрожжи ионизирующих излучений. Более слабый ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2018. Vol. 48. No. 2 92 эффект дают вещества – ингибиторы окислительного фосфорилирования и некоторые полиеновые антибиотики [1, 22]. Состав среды культивирования существенно влияет на биосинтез стеринов. Снижают выход стеринов большое количество азота в среде, ионы калия, стимулируют образование эргостерина кальций и магний, не влияют на него фосфорные соединения, ионы натрия [1]. Наиболее эффективными источниками углерода для стериногенеза являются углеводы. Наибольший прирост наблюдается при использовании глюкозы, рафинозы (100–200 %). Мальтоза и фруктоза оказывают менее заметный эффект (30–35 %) [25]. Ряд исследователей отмечают значение не самих углеводов в синтезе стеринов, а продуктов их распада [1, 23]. P. R. Starr и L. W. Parks [23] считают, что содержание продуктов деградации углеводов пропорционально уровню кофермента А в клетке. Авторы составили определенный ряд с уменьшающейся эффективностью в отношении стеринообразования: ацетат, этиловый спирт, глюкоза, мальтоза, глицерин, ксилоза и сукцинат. Этиловый спирт является хорошим экзогенным источником углерода для накопления стеринов дрожжевыми организмами [1, 15]. Этанол включается в синтез стеринов после превращения его в ацетат. При выдерживании дрожжевых клеток в атмосфере этилового спирта при хорошей аэрации содержание стеринов увеличивается в 4–5 раз. Наилучшей концентрацией данного вещества считается 2–4 % об., так как в большем количестве проявляются токсичные свойства спирта. Накоплению стеринов в дрожжевых клетках способствуют и органические кислоты с небольшим числом углеродных атомов. Среди таких кислот по усвояемости и по своему действию на синтез стеринов первое место занимает пировиноградная кислота (прирост стеринов 295 %), янтарная кислота дает прирост около 195 %, молочная – 160–175 %, уксусная – 100–105 %, яблочная – 90–100 % [23]. Вышеприведенные результаты были получены в основном при работе с пекарскими дрожжами. Что касается изучения процесса стеринообразования пивными дрожжами [15, 24–26], сведения об общем содержании стеринов в различных штаммах, влиянии на количественный и качественный состав стеринов разных условий снабжения культуры кислородом отражены в литературе недостаточно полно. Кислород – важнейший фактор, регулирующий рост и физиологическую активность дрожжевой клетки [16]. Используемый чаще всего в практике пивоварения способ обеспечения дрожжей кислородом путем аэрации среды ферментации хотя и способствует снижению потребности культуры в данном компоненте, но имеет много недостатков, главный из которых – ухудшение качественных показателей готового пива [16, 27–29]. Возможно, более эффективным приемом снижения потребности дрожжей в кислороде является аэрация инокулята перед введением в среду сбраживания. Имеются немногочисленные сведения по предферментационной аэрации дрожжей [16, 20, 30, 31]. В одних работах рекомендуется осуществлять подобную обработку в условиях минипивзаводов в течение 15 мин перед засевом в сусло для улучшения физиологического состояния клеток, при этом не указывается среда инокуляции [31], в других (на примере получения вина) – проводить аэрацию как жидкой разводки, так и сухих реактивированных дрожжей для предотвращения замедления или преждевременной остановки брожения в случае повышенного количества фунгицидов в сусле [30]. Нами предлагается подготовка семенной культуры пивных дрожжей перед введением в среду ферментации путем кратковременной аэрации инокулята с последующей выдержкой без доступа воздуха [15]. Насыщение кислородом воздуха дрожжевой суспензии направлено на синтез дополнительного количества в клетках факторов анаэробного роста, в первую очередь стеринов, анаэробная инкубация предотвращает переход обмена веществ с брожения на дыхание. Цель работы – изучение образования стеринов пивными дрожжами Saccharomyces cerevisiae при кратковременной аэрации инокулята в зависимости от состава среды суспендирования, а также в процессе последующей ферментации с учетом содержания кислорода в сусле. Объекты и методы исследований Объектом исследований служила чистая культура пивных дрожжей S. cerevisiae низового брожения расы 8(а) М третьего пассажа. Выбор расы обусловлен ее высокой потребностью в кислороде [15]. Культуру выращивали при температуре 28 °С под высоким слоем 11%-го пивного сусла, что обеспечивало относительно анаэробные условия и низкое содержание стеринов в биомассе. Данный образец служил контролем. Для аэрообработки полученную биомассу суспендировали в средах (1:2), в которых возможно хранение семенных дрожжей в условиях производства (в воде, 11%-ном пивном сусле, молодом пиве). Аэрацию инокулята проводили компрессором при расходе воздуха 100 дм3 /ч·дм3 среды в течение 30 мин при температуре 2–4 °С. Последующую выдержку дрожжей в анаэробных условиях длительностью 1–3 ч вели в колбах, закрытых сернокислотными затворами. Посевной материал вводили в сбраживаемую среду (11%-ное солодовое охмеленное сусло) из расчета 20 · 106 клеток/см3 . Процесс ферментации вели при температуре 8–9 °С. Для выделения стеринов из дрожжей отцентрифугированную биомассу гидролизовали 40%-ным раствором КОН в 96%-ном этиловом спирте в течение 1 ч на кипящей водяной бане. Стериновую фракцию из остывшего раствора дважды экстрагировали гексаном. Соотношение ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 2 93 объема спиртового раствора стеринов к объему гексана 1:0,75. Гексановый раствор промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и осушали над безводным сульфатом натрия в течение 1–2 суток. Затем раствор фильтровали и отгоняли из него гексан под вакуумом на роторном испарителе. Стерины хранили в закрытых бюксах при температуре не выше 4 °С. Для проведения дальнейших анализов продукт перерастворяли в гексане. Общее содержание стеринов определяли УФ-спектрофотометрическим методом путем измерения оптической плотности гексанового раствора стеринов при длине волны 282 нм. Найденную по калибровочному графику величину пересчитывали в проценты на сухое вещество дрожжей (% СВ). Качественный состав стеринов оценивали тонкослойной (ТСХ) и газожидкостной хроматографией (ГЖХ) [32]. Для ТСХ применяли пластины «Silufol» 200х200 мм, обработанные 20%-ным раствором AgNO3, в системе растворителей хлороформ-ацетон (95:5). Проявление хроматограмм вели FeCl3, растворенным в смеси кислот (ледяной уксусной и концентрированной серной). ГЖХ проводили на хроматографе «Цвет-100». Колонка стеклянная силанизированная, длиной 2,5 м, с внутренним диаметром 2 мм, заполненная фенилсиликоновой фазой ОУ-17 на носителе «Chromaton N-Super (Чехия). Температура колонки – 280 °С, температура детектора – 290 °С, расход гелия – 25 см3 /мин. Относительное время удерживания рассчитывали по холестерину. «Свидетелями» при ТСХ служили индивидуальные стерины, выделенные из мутантных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae: эргоста-5,7-диен-3β-ол, эргоста-7,22- диен-3β-ол, 24(28)-дигидроэргостерин, ланостерин, зимостерин; при ГЖХ дополнительно – эргоста-8- ен-3β-ол, эргоста-8,24(28)-диен-3β-ол. Кроме того, использовали сквален, эргостерин («Фармакон», г. Санкт-Петербург) и холестерин («Меrck», Германия) как структурный аналог различных интермедиатов биосинтеза стеринов у дрожжей. Структуру неидентифицированных ранее стеринов устанавливали методом хромато-массспектрометрии на приборе «КВ-2091» (Швеция). Ввод осуществляли через капиллярную колонку газожидкостного хроматографа. Фаза ОУ-17, температура колонки и сепаратора – 250 °С, ионного источника – 260 °С, ускоряющее напряжение – 3,5 кВ, энергия ионизирующих электронов – 70 эВ. Физиологическое состояние дрожжей оценивали методом прямого счета в камере Горяева по количеству клеток во взвешенном состоянии и почкующихся. Массовую долю сухих веществ сбраживаемого сусла анализировали ареометрическим способом с последующим расчетом видимой степени сбраживания. Технологические характеристики дрожжей (скорость сбраживания, выход клеток, время генерации) определяли в соответствии с рекомендациями Европейской пивоваренной конвенции (ЕВС), используя значения таких величин, как содержание экстракта и дрожжевых клеток в бродящей среде. Исследования проводили в трех-четырех повторностях и обрабатывали статистически по Фишеру – Стьюденту при уровне надежности 95 %. Результаты и их обсуждение На первом этапе работы исследовали влияние предферментационной аэрообработки дрожжей в разных средах на общее содержание стеринов. Из данных рис. 2 видно, что через 30 мин аэрации при достижении полного насыщения суспензии кислородом воздуха (от 11 мг/дм3 при инкубировании в молодом пиве до 15 мг/дм3 – в воде) в клетках дрожжей концентрация стеринов возросла в 2,0–3,6 раза в сравнении с исходным значением и в зависимости от среды суспендирования. Интенсивный синтез стеринов в этот период времени можно объяснить быстрым превращением образовавшихся на стадии анаэробного выращивания культуры предшественников. Уже на стадии циклизации сквалена кислород необходим для превращения его в сквален-2,3-оксид, который и подвергается циклизации в ланостерин при участии циклазы сквален-2,3-оксида. На последующих этапах в процессе деметилирования у С4 и С14 атомов ланостерина тоже требуется кислород, так как в этих реакциях участвуют оксидазы со смешанной функцией [1]. В первые часы после прекращения аэрации биосинтез эргостерина продолжался с высокой скоростью с дальнейшим снижением ее по мере исчерпания кислорода из среды. После 2 ч инкубации без доступа кислорода воздуха наблюдался даже некоторый спад концентрации эргостерина в клетках, что, возможно, связано с потреблением его для построения мембран. Максимальное содержание эргостерина в дрожжах в 4,4–7,2 раза больше, чем в исходной культуре. При использовании в качестве среды инкубации сусла, и особенно пива, стериногенез дрожжей протекал более интенсивно. Сахара являются ценными источниками углерода для стеринообразования [1, 10]. В результате их окисления образуется непосредственный предшественник эргостерина ацетил-КоА, из трех молекул которого синтезируется мевалоновая кислота. Этиловый спирт молодого пива может быть использован в биосинтезе эргостерина после окисления в ацетат в присутствии молекулярного кислорода. В молодом пиве кроме спирта содержатся и другие вещества, стимулирующие накопление стеринов в клетках. Все это способствовало тому, что в дрожжах, суспендированных в молодом пиве, содержание эргостерина на 16 и 73 % выше, чем в биомассе, инкубированной в сусле и воде соответственно. ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2018. Vol. 48. No. 2 94 Рисунок 2 – Изменение концентрации кислорода и стеринов в дрожжевой суспензии в процессе подготовки инокулята в разных средах (на оси абсцисс цифрами указана длительность аэрации (30 мин) и анаэробной выдержки инокулята (60–180 мин)) Figure 2 – Figures on the X-axis indicate the changes in oxygen and sterols concentration in the yeast suspension during preparation of the inoculum in different media (the duration of aeration (30 min) and anaerobic exposure of inoculum (60–180 min)) Таблица 1 – Влияние аэрообработки дрожжей на количество клеток с гликогеном Table 1 – Influence of yeast aeration on the number of cells with glycogen Среда обработки Содержание клеток с гликогеном, % от общего длительность, ч аэрации анаэробной выдержки – 30 1 2 3 вода 60,7 54,4 52,7 46,3 41,5 пивное сусло 60,7 59,2 58,0 54,0 50,3 молодое пиво 60,7 58,6 57,2 52,3 47,5 Рисунок 3 – Разделение фракций стеринов у дрожжей Saccharomyces cеrеvisiae (исходная культура) методом ТСХ: 1– эргостерин, 2 – эргоста-5,7-диен-3-β-ол, 3 – эргоста-7,22-диен-3-β-ол, 4 – фекостерин, 5 – зимостерин, 6 – ланостерин; I – раствор стеринов, выделенных из исходной культуры дрожжей, II–VII – свидетели Figure 3 – Separation of sterol fractions in the yeast Saccharomyces cеrеvisiae (stock yeast culture) by means of thin-layer chromatography (TLC): 1 – ergosterol; 2 – ergosta-5,7-dien-3β-ol; 3 – ergosta-7,22-dien-3-βol; 4 – fecosterol; 5 – zymosterol; 6 – lanosterol; I – solution of sterols isolated from the stock yeast culture, II–VII – markers Необходимо отметить, что в отсутствии экзогенных источников углерода для синтеза стеринов клетки могут использовать эндогенные ресурсы, в первую очередь гликоген и трегалозу [1, 16]. Во всех исследуемых образцах наблюдается снижение количества клеток с резервным полисахаридом по отношению к исходному значению, особенно заметное в варианте с аэрацией в воде (табл. 1). Однако ограниченное количество эндогенных субстратов энергетического обмена не позволяет использовать кислород среды в полной мере и обеспечить тот же уровень стеринонакопления, который наблюдается при суспендировании дрожжевой культуры в сусле и молодом пиве. Учитывая, что углеводы и продукты их метаболизма стимулируют биосинтез стеринов, при проведении аэрации культуры целесообразно использовать в качестве среды обработки молодое пиво. В дальнейшем подготовку инокулята вели в этой среде. В ряде работ имеются указания на то, что нормальный ход брожения зависит не только от общего количества стеринов в семенных дрожжах, но и от соотношения их различных фракций [21]. Спектрофотометрический метод анализа не может дать точной информации о составе стериновых фракций, так как позволяет судить лишь о наличии определенных функциональных группировок, характерных для структуры тех или иных стеринов. Был изучен качественный состав стеринов дрожжей в процессе их обработки. Предварительную идентификацию отдельных фракций стеринов проводили методом тонкослойной хроматографии, а для уточнения состава и количественной оценки использовали газожидкостную хроматографию. Анализировали неомыляемые фракции исходной культуры дрожжей, а также клеток, суспендированных в молодом пиве, после 30 мин аэрации и последующей выдержки без доступа воздуха в течение 2 ч. Результаты исследований показали, что раствор стеринов при разгонке в тонком слое дает шесть фракций, которые по своему качественному составу сходны у всех анализируемых образцов и представлены следующими соединениями: эргостерином, эргоста-5,7-диен-3-β-олом, фекостерином, эргоста-7,22-диен-3-β-олом, зимостерином и ланостерином с его метилированными производными (рис. 3). По данным газожидкостной хроматографии в отличие от ТСХ выявлено 5 соединений: сквален, ланостерин, 24(28)-дигидроэргостерин, эргостерин и неидентифицированный компонент (рис. 4, τi – относительное время удерживания по холестерину). Из представленных результатов видно, что в процессе обработки дрожжей существенно изменяется содержание только двух компонентов: сквалена и эргостерина. Изменение количества ланостерина и 24(28)-дигидроэргостерина менее значительно. В исходных клетках дрожжей, выращенных анаэробно, накапливается эргостерина приблизительно в 2 раза меньше, чем сквалена. Однако предферментационная обработка инокулята кислородом воздуха приводит к снижению доли сквалена (на 23 %) и увеличению эргостерина (на 52 %) и его непосредственных предшественников по отношению к первоначальному значению. 0 5 10 15 исх. 30 60 120 180 исх. 30 60 120 180 исх. 30 60 120 180 вода сусло молодое пиво Значение показателя кислород, мг/дм куб. стерины, % СВ дрожжей I II III IV V VI VII 6 5 4 3 2 1 3 ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 2 95 Рисунок 4 – Состав стериновых фракций дрожжей в процессе обработки культуры (А – после 30 мин аэрации, Б – после 2 ч выдержки без доступа воздуха): 1 – сквален, τi = 0,38; 2 – ланостерин, τi = 1,68; 3 – 24(28)-дигидроэргостерин, τi = 1,55; 4 – эргостерин, τi = 1,33; 5 – неидентифицированный компонент, τi = 2,10 Figure 4 – Composition of the yeast sterols fractions during the processing of the culture (A – after 30 min of aeration, B – after 2 hours of exposure without air access): 1 – squalene, τi = 0.38; 2 – lanosterol, τi = 1.68; 3 – 24 (28)-dihydroergosterol, τi = 1.55; 4 – ergosterol, τi = 1.33; 5 – unidentified component, τi = 2.10 Рисунок 5 – Изменение концентрации кислорода (мг/дм3 ) в сусле и стеринов (% СВ) в дрожжах в процессе ферментации среды Figure 5 – Change in oxygen concentration (mg/l) in wort and sterols (percentage of dry matter) in yeast during medium fermentation Таким образом, непродолжительная аэрация микробной биомассы в молодом пиве с последующей выдержкой без доступа воздуха позволяет значительно увеличить содержание в клетках эргостерина и тем самым обеспечить возможность анаэробного роста популяции дрожжей при сбраживании сусла. В исследуемых образцах присутствует компонент с относительным временем удерживания τi = 2,10, который не удалось идентифицировать с использованием имеющихся свидетелей. Соединением с такой величиной τi должен быть стерин, имеющий молекулярную массу больше, чем ланостерин. Известно, что фермент 24-метилтрансфераза, осуществляющий реакцию метилирования 24 атома углерода боковой цепи стеринов, не имеет строгой субстратной специфичности [4]. Действию данного биокатализатора могут подвергаться различные метилированные предшественники эргостерина, в том числе и ланостерин. Для установления структуры нераспознанного соединения использовали метод хромато-массспектрометрии. В полученном масс-спектре были выявлены пики, соответствующие фрагментации 24-метилен-24,25-дигидроланостерина (m/z 200):М+ 440 (24); 425 (61); 407 (20); 273 (5); 259 (16) (первая цифра – отношение массы иона (m) к заряду иона (z), вторая цифра в скобках – относительная интенсивность основного пика (М+ )). Такая идентификация подтверждается опубликованным масс-спектром этого соединения [22]. С целью выяснения целесообразности аэрации сбраживаемой среды для синтеза стеринов в дрожжах в сравнении с аэрообработкой инокулята исследовали динамику стеринообразования при ферментации сусла с различным содержанием растворенного кислорода ((4,0 ± 0,5); (8,0 ± 0,5); (16,0 ± 0,5) мг/дм3 ). Концентрация кислорода (4,0 ± 0,5) мг/дм3 обеспечивалась за счет естественного растворения его в сусле, (8,0 ± 0,5) и (16,0 ± 0,5) мг/дм3 – путем дополнительной аэрации среды сжатым воздухом. Сусло с концентрацией (4,0 ± 0,5) мг О2/дм3 сбраживали инокулятом после предферментационной обработки, два других варианта сусла – исходными дрожжами (без подготовки). Динамика количественного изменения в дрожжах фактора анаэробного роста в разных условиях снабжения популяции кислородом показывает (рис. 5), что во всех исследуемых вариантах максимум накопления стеринов в клетках достигался в первые 24 ч культивирования. Наибольшее количество стеринов (5,3 % СВ) содержится в дрожжах, подвергнутых предварительной аэрации, хотя концентрация кислорода в среде незначительна (4,0 ± 0,5 мг/дм3 ). В этом случае прирост стеринов в клетках за счет новообразования составил 1,9 % СВ, в вариантах с содержанием кислорода (8,0 ± 0,5) и (16,0 ± 0,5) мг/дм3 – 3,1 и 4,0 % СВ соответственно. В двух последних образцах основное количество стеринов в дрожжах образовалось непосредственно в ходе культивирования, т. е. дополнительный синтез стеринов зависел от концентрации кислорода в среде. В то же время возрастание уровня кислорода в сусле приводит к снижению прироста стеринов на единицу потребленного кислорода (рис. 6). 50,1 53,7 38,7 16,3 18,3 18,6 9,4 1,4 8,0 22,7 26,5 34,6 1,5 0,1 0,1 0 10 20 30 40 50 60 дрожжи исх. А Б Содержание, % от общего Компоненты фракций стеринов 1 2 3 4 5 0 4 8 12 16 исх. 24 48 72 168 исх. 24 48 72 168 Значение показателя Длительность брожения, ч Содержание кислорода в исходном сусле, мг/дм3 кислород стерины 4 8 16 ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2018. Vol. 48. No. 2 96 Рисунок 6 – Прирост стеринов в дрожжах после 24 ч брожения при разном исходном содержании О2 в сусле Figure 6 – Increase of sterols level in yeast after 24 hours of fermentation with different initial oxygen content in wort Таблица 2 – Изменение количества почкующихся клеток (% от общего) в процессе главного брожения Table 2 – Change in the budding yeast cells number (as percentage of total number) during the main fermentation Содержание О2 в сусле, мг/дм3 Длительность брожения, сут 0 1 2 3 4 5 6 7 4 20 48 71 58 50 32 22 12 8 14 45 57 70 53 35 20 14 16 14 50 62 84 60 42 21 10 Рисунок 7 – Состав стериновых фракций дрожжей после 7 суток брожения (расшифровку обозначений см. на рис. 4) Figure 7 – Composition of yeast sterol fractions after 7 days of fermentation (legend is given in Figure 4) Таблица 3 – Технологические характеристики дрожжей и видимая степень сбраживания сусла (ВСС) в различных условиях снабжения кислородом Table 3 – Yeast technological characteristics and the apparent degree of wort attenuation under different conditions of oxygen supply Показатель Исходный уровень О2 в сусле, мг/дм3 4 8 16 Удельная скорость роста, ч-1 0,020 0,023 0,031 Время генерации, ч 33,8 31,2 26,4 Выход клеток, 106 /см3 37,1 46,3 58,5 ВСС, % 62,7 63,2 59,1 В дальнейшем, в процессе ферментации, начавшееся размножение дрожжей (табл. 2) приводит к снижению содержания стеринов в результате их перераспределения между материнской и дочерней клетками. Не исключена также возможность использования стеринов и в энергетических процессах [1, 2]. В результате к концу культивирования клетки значительно обедняются стеринами. В образце с аэрацией инокулята и начальным содержанием кислорода в сусле (4,0 ± 0,5) мг/дм3 стеринов содержалось в 1,9 раза меньше в сравнении с исходным значением (сразу после аэрообработки), но в 1,3 и 3,0 раза больше, чем в дрожжах без подготовки, сбродивших сусло с концентрацией кислорода соответственно (16,0 ± 0,5) и (8,0 ± 0,5) мг/дм3 . Результаты ГЖХ показали (рис. 7), что по своему качественному составу стериновые фракции исследуемых дрожжей в вариантах сбраживания сусла с разным исходным содержанием кислорода сходны между собой, однако в количественном отношении различны. В дрожжах, прошедших предферментационную обработку, к 7-м суткам брожения содержание эргостерина на 14 % выше, чем в образце с аэрацией сусла (8,0 ± 0,5 мг/дм3 ) на тот же период времени, и на 7 и 13 % меньше по сравнению, соответственно, со своей стартовой величиной и вариантом насыщения среды кислородом воздуха (16,0 ± 0,5) мг/дм3 . Начальный относительно низкий уровень кислорода (4,0 ± 0,5 мг/дм3 ) в сусле способствовал накоплению сквалена в дрожжах к концу ферментации на 13 % больше, чем в исходном инокуляте. При последующем засеве такой культуры в сусло, даже с минимальным уровнем насыщения кислородом воздуха, исходного материала для синтеза эргостерина, будет достаточно для осуществления нормального процесса размножения биомассы. В то же время в условиях повышенного содержания кислорода ((8,0 ± 0,5) и (16,0 ± 0,5) мг/дм3 ) дрожжи характеризуются снижением (на 14 и 26 % соответственно) количества сквалена по отношению к первоначальному значению. Дрожжи после предферментационной подготовки обеспечили интенсивность размножения и глубину сбраживания экстракта сусла при относительно низкой концентрации кислорода в среде ферментации на уровне образца с содержанием кислорода (8,0 ± 0,5) мг/дм3 (табл. 3), но при меньшем приросте биомассы с учетом исходного засева (20 · 106 клеток/см3 ). Полученные результаты позволяют говорить о снижении потребности дрожжевой культуры в кислороде за счет синтеза стеринов на этапе предварительной аэрообработки инокулята. В варианте с аэрацией сусла на уровне (16,0 ± 0,5) мг/дм3 , несмотря на высокую удельную скорость размножения дрожжей, видимая степень сбраживания была на 6–7 % меньше, чем в других образцах, что, вероятно, связано с изменением направленности клеточного метаболизма в сторону 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 4 8 16 Прирост стеринов, % СВ/мг О2 Исходное содержание кислорода в сусле, мг/дм3 43,9 43,2 37,3 14,1 15,4 16,7 9,1 9,7 5,1 32,1 27,6 36,8 0,8 4,1 4,1 0 10 20 30 40 50 4 8 16 Содержание, % от общего Концентрация кислорода в сусле, мг/дм3 Компоненты фракций стеринов 1 2 3 4 5 ISSN 2074-9414. Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 2 97 конструктивного обмена веществ. Подтверждением является более значительный (в 1,3 и 1,6 раза) выход биомассы по сравнению с использованием уровня кислорода в сусле (8,0 ± 0,5) и (4,0 ± 0,5) мг/дм3 соответственно. Выводы Таким образом, полученные результаты исследований свидетельствуют, что наиболее благоприятной для синтеза стеринов средой инкубирования пивных дрожжей Saccharomyces cеrеvisiae низового брожения на стадии предферментационной аэрообработки является молодое пиво. Предварительная аэрация инокулята в среде, содержащей углеводы и продукты их деградации, обеспечивает высокий уровень содержания эргостерина в клетках на стадии ферментации при низкой концентрации кислорода в сусле, создавая условия для нормального роста культуры и сбраживания экстрактивных веществ. Это позволяет отказаться от традиционной аэрации сусла и использовать уровень насыщения среды кислородом воздуха, который обеспечивается в результате его естественного растворения.

1. Гальцова, Р. Д. Стеринообразование у дрожжевых организмов / Р. Д. Гальцова. - М. : Наука, 1980. - 224 с.

2. Валитова, Ю. Н. Растительные стерины: многообразие, биосинтез, физиологические функции / Ю. Н. Валитова,А. Г. Сулкарнаева, Ф. В. Минибаева // Биохимия. - 2016. - Т. 81, вып. 8. - С. 1050-1068.

3. Yaoita, Y. Terpenoids and sterols from мushrooms / Y. Yaoita, M. Kikuchi, K. Machida // Studies in Natural ProductsChemistry. - 2015. - Vol. 44. - P. 1-32. https://doi.org/10.1007/s13205-014-0220-2.

4. Localization of the enzymes involved in late stage of ergosterol biosynthesis in yeast / T. Nishimo [et al.] // Journal ofBiochemistry. - 1981. - Vol. 89, № 5. - P. 1391-1396.

5. Мысякина, И. С. Роль стеринов в морфогенетических процессах и диморфизме грибов / И. С. Мысякина,Н. С. Фунтикова // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 1. - С. 5-18.

6. Dufourc, E. J. The role of phytosterols in plant adaptation to temperature / E. J. Dufourc // Plant Signaling & Behavior. -2008. - № 3. - Р. 133-134. https://doi.org/10.4161/psb.3.2.505.

7. Мембранные липиды и углеводы цитозоля у Aspergillus niger в условиях осмотического, окислительного ихолодового воздействий / Е. А. Януцевич [и др.] // Микробиология. - 2016. - Т. 85, № 3. - С. 283-292.https://doi.org/10.7868/S0026365616030174.

8. Котельникова, А. В. Биохимия дрожжевых митохондрий / А. В. Котельникова, Р. А. Звягильская. - М. : Наука,1973. - 239 с.

9. Influence of fatty acid and sterol composition on the lipid phase transition and activity of membrane-bound enzymes inAcholeplasma laidlawii / De Kruyff B. [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta. - 1973. - Vol. 330. - Р. 269-282.https://doi.org/10.1016/0005-2736(73)90232-0.

10. Lees, N. D. Sterol biochemistry and regulation in the yeast Saccharomyces сerevisiae / N. D. Lees, M. Bard // Biochimicaet Biophysica Acta. - 2003, December 6. - Р. 141-150. https://doi.org/10.1007/978-3-540-40999-1_7.

11. Sterol regulatory element binding protein is a principal regulator of anaerobic gene expression in fission yeast /B. L. Todd [et al.] // Molecular and Cellular Biology. - 2006. - Vol. 26, № 7. - P. 2817-2831.https://doi.org/10.1128/MCB.26.7.2817-2831.2006.

12. Snoek, S. I. Factors involved in anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiae / S. I. Snoek, H. Y. Steensma // Yeast. -2007. - Vol. 24, № 1. - Р. 1-10. https://doi.org/10.1002/yea.1430.

13. Ergosterol synthesis and population analysis of a fed-batch fermentation in Saccharomyces cerevisiae / A. Pichová [et al.]// Folia Microbialogica. - 1985. - Vol. 30, № 2. - Р. 134-140. https://doi.org/10.1007/BF02922206.

14. Ефимова, С. С. Исследование каналообразующей активности полиеновых антибиотиков в липидных бислоях сиспользованием дипольных модификаторов / С. С. Ефимова, Л. В. Щагина, О. С. Остроумова // Acta Naturae. - 2014. - Т. 6,№ 4 (23). - С. 72-85.

15. Пермякова, Л. В. Исследование различных способов снижения потребности дрожжей в кислороде /Л. В. Пермякова // Техника и технология пищевых производств. - 2015. - Т. 38, № 3. - С. 41-50.

16. Annemuller, G. The yeast in the brewery / G. Annemuller, H.-J. Manger, P. Lietz. - Berlin : VLB Berlin, 2011. - 430 p.

17. Jakobsen, М. Oxygen requirements of brewing strains of Saccharomyces uvarum (carlsbergensis) - bottom fermentationyeast / М. Jakobsen, R. S. W. Thorne // Journal of the Institute of Brewing. - 1980. - Vol. 86, № 6. - P. 284-287.https://doi.org/10.1002/j.2050-0416.1980.tb06882.

18. Расы дрожжей для сбраживания плотного сусла / Т. И. Филимонова [и др.] // Пиво и напитки. - 2004. - № 1. -С. 22-23.

19. Косминский, Г. И. Выбор расы пивоваренных дрожжей для безалкогольного пива / Г. И. Косминский,Е. М. Моргунова, О. И. Иванчикова // Пиво и напитки. - 2006. - № 2. - С. 32-33.

20. Зубковская, О. Л. Влияние технологических факторов на сокращение процесса брожения при изготовлениифруктово-ягодных натуральных виноматериалов / О. Л. Зубковская, Т. М. Тананайко, А. Н. Гацевичус // Пищеваяпромышленность: наука и технологии. - 2014. - № 3 (25). - С. 50-57.

21. The role of oxygen in yeast metabolism during high cell density brewery fermentations / P. J. Verbelen [et al.] // AppliedMicrobiology and Biotechnology. - 2009. - Vol. 82. - P. 1143-1156. https://doi.org/10.1007/s00253-009-1909-8.

22. Михайлова, Н. П. Стерины некоторых мутантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, устойчивых к нистатину /Н. П. Михайлова, А. В. Мосейчук, К. В. Вьюнов // Биотехнология. - 1986. - № 1. - С. 31-35. ISSN 2074-9414. Food Processing: Techniques and Technology. 2018. Vol. 48. No. 298

23. Starr, P. R. Some factors affecting sterol formation in Saccharomyces cerevisiae / P. R. Starr, L. W. Parks // Journal ofBacteriology. - 1962. - Vol. 83, № 5. - P. 1042-1045.

24. Ginova-Stojenova, T. Syntëza ergosterolu a aktivite pivovarskýh kvasinek / T. Ginova-Stojenova, V. Janeva / Kvasnýprůmysl. - 1985. - Vol. 31, № 9. - P. 201-204. (In Czech).

25. Basarová, G. Ergosterol v odpadních peivovarských kvasnicích / G. Basarová, L. Löblová // Kvasný průmysl. - 1987. -Vol. 33, № 3. - P. 65-68. (In Czech).

26. Логунова, А. С. Методы выделения и сравнительная характеристика эргостерина, полученного из пивных ихлебопекарных дрожжей / А. С. Логунова, Л. А. Бахолдина // Технологии и оборудование химической, биотехнологическойи пищевой промышленности : материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов имолодых ученых с международным участием. - Бийск, 2015. - С. 491-495.

27. Меледина, Т. В. Качество пива: стабильность вкуса и аромата, коллоидная стойкость, дегустация / Т. В. Меледина, А. Т. Дедегкаев, Д. В. Афонин. - СПб. : Профессия, 2011. - 220 с.

28. Kucharczyk, K. The effect of wort aeration on fermentation, maturation and volatile components of beer produced on anindustrial scale / K. Kucharczyk, T. Tuszyński // Journal of the Institute of Brewing. - 2017. - Vol. 123, № 1. - Р. 31-38.https://doi.org/10.1002/jib.392.

29. Рапота, М. О. Влияние фитостеринов на сенсорную стабильность пива / М. О. Рапота, М. Н. Елисеев // Успехисовременной науки и образования. - 2016. - Т. 2, № 8. - С. 163-166.

30. Gnaegi, F. Fongicides viticoles et fermentation / F. Gnaegl // Revue Française dʼŒnologie. - 1985. - Vol. 25, № 99. -P. 9-13. (In French).

31. Влияние кислорода на кинетику биологических процессов при сбраживании пивного сусла / В. Б. Тишин [и др.] //Хранение и переработка сельхозсырья. - 2010. - № 4. - С. 29-32.

32. Кейтс, M. Техника липидологии / М. Кейтс. - М. : Мир, 1975. - 322 с.